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沉降菌和浮游菌有哪些區別?采樣方式該如何選擇?

更新時間:2025-02-24點擊次數:4233

沉降菌和浮游菌有哪些區別?采樣方式該如何選擇?

 

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沉降菌與浮游菌監測作為日常生產過程中微生物監測的兩種方式,一直在被大家廣泛使用。

 

這兩者究竟有何區別呢?本篇文章將帶你詳細了解。

浮游菌和沉降菌的區別是什么?

1.性質不同

 

沉降菌:是用標準提及的方法收集到的活微生物粒子,通過專用的培養基,在適宜的生長條件下繁殖到可見的菌落數。

 

浮游菌:收集懸浮在空氣中的活微生物粒子,通過專門的培養基,在適宜的生長條件下繁殖到可見的菌落數。

2.測試方法不同

 

 沉降菌:沉降菌采用沉降法,即通過自然沉降原理收集在空氣中的生物粒子于培養基平皿,經若干時間,在適宜的條件下讓其繁殖到可見的菌落進行計數,以平板培養皿中的菌落數來判定潔凈環境內的活微生物數,并以此來評定潔凈室(區)的潔凈度。

 

浮游菌:浮游菌采用計數濃度法,即通過收集懸游在空氣中的生物性粒子于專門的培養基,經若干時間,在適宜的生長條件下讓其繁殖到可見的菌落進行計數,從而判定潔凈環境內單位體積空氣中的活微生物數,以此來評定潔凈室()的潔凈度。測試時需選擇合適的浮游菌采樣器。

 

3.結果測評要求不同

 

沉降菌:沉降菌采用沉降法,即通過自然沉降原理收集在空氣中的生物粒子于培養基平皿(一般多采沉降菌:沉降菌測試前,被測試潔凈室(區)的溫濕度須達到規定的要求,靜壓差、換氣次數、空氣流速須控制在規定值內。測試前,被測試潔凈室(區)已經過消毒。測試狀態有靜態和動態兩種,測試狀態的選擇須符合生產的要求,并在報告中注明測試狀態。

 

浮游菌:浮游菌每個測點的浮游菌平均濃度須低于所選定的評定標準中關于細菌濃度的界限。若某測點的浮游菌平均濃度超過評定標準,則應對此區域先進行消毒,然后重新采樣兩次,兩次測試結果必須合格。

 

沉降菌和浮游菌采樣方法該如何選擇?

 

 

法規要求

 

GMP對于制藥行業內測試方法需要參照ISO的測試方法,而ISO 14698-1微生物污染控制法規提到微生物監測需要評估收集效率(Collection efficiency ),高的收集效率的采樣方法和采樣設備可以得到更有代表性的數據。對于生物負載環境低的環境,如B級環境,應當更多的采用主動采樣的浮游菌采樣,而不是被動采樣的沉降菌方法。

 

ISO 14698-1 附錄中對于微生物采樣器的收集效率提出了進行收集效率評估的指導意見。現行的2003版的ISO14698對于收集效率分為物理收集效率和生物收集效率,其中物理收集效率更在意的是采樣方法是否有能力收集到空氣的攜菌粒子,而生物收集效率更在意的是采樣器或者采樣方法是否能在收集到的同時保證該攜菌粒子的存活率。

 

 

沉降菌的采樣效率

 

基于地心引力的被動采樣方式,能夠得到12微米粒徑的活性粒子沉降到9cm的采樣平皿上的收集效率為0.106 CFU/h,沉降到14cm的采樣平皿上的收集效率0.256CFU/h。而對于1微米粒徑的活性粒子沉降到9cm 的采樣平皿上的收集效率為0.008 CFU/h 。如果級區zui大濃度限度為1CFU/m3, 那么一個9cm平皿需要暴露于級區采樣1250小時(相當于52天),才能在低生物污染負載環境檢測到一個有意義的數據(一個CFU)。

 

所以:沉降菌“是一種太不靈敏的采樣方法",以及“沉降菌更好的反映了攜菌粒子的沉積效果,僅在較大平皿采樣(如14cm)或者多個采樣平皿采集時靈敏些"。對于主動采樣方法采集1微米的粒子的收集效率比9cm的被動采集的沉降菌方法的效率高2250倍。對于級區層流環境的微生物采樣,建議采用更加靈敏的采樣方法。

 

沉降菌等采樣方法對于相對微生物負載量較高的非無菌工藝的CD級環境,可以作為一個微生物采樣的補充,配合浮游菌采樣方法可以一起使用。對于B級環境,浮游菌采樣方法作為更高效的采樣方法更適合。

 

 

日常監測中的風險

 

如大家所知,歐盟GMP無菌生產的附錄一的草案于20171224日發布,其中非常大的變化在于:

 

)微生物及相關的提法增加了2倍(原附錄提到23次,新草案提到68次)

 

b)對于風險的提法增加了將近4倍(原附錄提到20此,新草案提到92次)。

 

因此可以了解監管部門對于微生物和風險的要求重視程度達到未有的高度。其中對于日常監測中,新附錄9.7條提Ji區的活性粒子(微生物)監測位置應該是無菌生產污染風險最高的位置,如無菌表面,開口的容器膠塞等。而在9.29條提到,活性粒子(微生物)的采樣方法不應當對于制藥生產帶來任何污染的風險(Reference 2)。因此,我們可以看到監管部門的想法,他既認為微生物監測非常重要,又認為采用不恰當的采樣方法會對生產環境帶來負面影響。

 

圖片

這是我們行業的一個兩難。之前很多企業由于無法找到一個合適的微生物方法,擔心浮游菌采樣方法的平皿頻繁更換會對制藥環境帶來污染,因此決定不進行主動微生物(浮游菌)監測。隨著現代制藥工業發展,我們已經認識到了需要提升我們對于微生物采樣方法的風險評估和風險識別。

 

沉降菌方法可能會對于環境造成污染,我們知道沉降菌表面有大量的營養水分,在10微米至20微米之間,當沉降菌暴露在關鍵生產的ji環境中,這些營養水分很可能會被吹到無菌表面,藥瓶容器內,藥液當中,造成污染和交叉污染。

 

浮游菌采樣由于培養基比較容易干燥,現代的采樣流速設計為低流速采樣,可以盡量的延長浮游菌采樣的覆蓋生產的時間,不要頻繁進行平皿更換介紹。通常會考慮到ji層流環境的氣流保護的目的,我們對浮游菌采樣也要進行等動力采樣設計,確保采樣器上方的空氣呈現等速采樣,不會對現場造成污染。

 

傳統的微生物采樣方法為把整個采樣器放入ji環境,而現代的無菌工藝控制方法要求任何進入ji的材料設備都要進行充分的滅菌。傳統方法把采樣器放入ji,由于采樣器內部的線路板電氣部件無法進行的滅菌,通常企業采樣VHP或者酒精消毒采樣器表面,無法到達的滅菌的效果。WHO無菌工藝控制要求中建議制藥企業應當采樣分體式的微生物采樣方法,即把采樣頭和采樣器進行分離,采樣頭放入ji并可提前進行高溫或者化學滅菌,而采樣器放在B級背景環境進行操作。這樣的話,可以規避采樣器無法滅菌對于ji區的影響。

 

 

結論

 

綜上所述,經過效率驗證的浮游菌采樣方法對比沉降菌采樣方法的收集效率更為高效,適合用于關鍵的,生物負載低的無菌生產環境。

 

沉降菌采樣方法可作為一種生產過程中浮游菌采樣的補充方法,可用于相對不關鍵,生物負載高的非無菌環境,使用時需要避免放置位置不當或者操作錯誤而造成的污染風險。

 

無論采用何種方法,都應當基于生產工藝的風險評估來確定位置,采樣頻率,采樣覆蓋時間以及采樣流速等。

 

沉降菌和浮游菌作為制藥生產過程中的監測方法,我們應當基于風險評估來選擇和考慮采用哪一種方法。

 

現代的無菌制藥控制對于關鍵區微生物采樣更傾向于主動采樣方式(浮游菌),而不是低靈敏度的被動采樣方法(沉降菌),需要重視采樣方法對于生產環境的影響,提高無菌工藝控制水平和基于風險評估的科學方法。


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